Las fotos del ADN

Estructura química del bromuro de etidio
Estructura química del bromuro de etidio

Ahora que estoy terminando de escribir la ansiada tesis doctoral, me hubiera gustado poder enseñar como he ido trabajando en el laboratorio día a día. Una de las labores cotidianas es realizar fotografías de los geles de electroforesis que contienen los fragmentos de ADN previamente amplificados mediante PCR para poder analizarlos posteriormente con más detenimiento. Esas imágenes se han podido ver en infinidad de documentales y series de televisión. Son esas fotografías en las que salen una serie de bandas que pertenecen a cada uno de los productos de PCR (aunque también pueden ser digestiones con enzimas u otro tipo de análisis a nivel molecular).
Resumiré las nociones básicas de por qué se ven las bandas de ADN gracias al bromuro de etidio (cada día en más desuso por la utilización de otros agentes intercalantes como el Sybr green, con relativo menor peligro mutagénico) y el por qué de su «iluminación» al incidir los rayos ultravioleta. Cuando se expone el bromuro de etidio (ó Bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio) a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágenico y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.

Distorsión de la hélice de ADN por la inserción del bromuro de etidio entre las pares de bases AT (adenina y timina) y TA. Imágenes procedentes de sandwalk.blogspot.com y artículo en JACS de Reha et al., 2003.

Estructura química del Sybr green
Estructura química del Sybr green

Desde que lanzaron el conocido Sybr green los laboratorios Invitrogen®, parecía que el miedo que siempre nos metían a todos los científicos sobre lo malo que era este compuesto desaparecería con el nuevo «invento verde». Esta molécula se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla energéticamente a los ácidos nucleicos que lo forman, de manera que se incrementa notablemente su tasa de emisión fluorescente. Este fenómeno se conoce como transferencia de energía mediante resonancia de fluorescencia. El complejo resultante ADN-SYBR Green presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el pico de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, de ahí su nombre). Ese «miedo» sobre la genotoxicidad del bromuro de etidio que nos intercalaban en nuestras mentes no está muy bien determinado. Como se explicó en 2006 en rrresearch.fieldofscience.com por Rosie Redfield, esa posibilidad mutagénica no está demostrada y las cantidades para que ocurra son increíblemente elevadas. Casi todas las marcas que lo distribuyen muestran los resultados del test de Ames que demuestran el pase de este Sybr green como no mutagénico. Sin embargo, parece ser que existen estudios (ver artículo anteriormente enlazado) en los que se demuestra una mayor toxicidad en ratones con este compuesto que con el bromuro de etidio. Lo malo es que no se suelen explicar todos los pros y contras de cada compuesto como se debería. Y los agentes de ventas de las casas que comercializan estos compuestos tampoco conocen todo sobre ellos. Y no tienen por qué ser completamente transparentes si omitiendo datos consiguen ventas. Lo importante no es echar culpas si no ser precavidos e informarse debidamente.

Una vez dicho todo esto sobre lo que esconden nuestros geles teñidos, quería mostrar que los investigadores del centro TNAU Genomics & Proteomics parece que me han leído el pensamiento y han elaborado un vídeo sobre esta toma de imágenes. Lo bueno es que es exactamente el mismo equipo que usamos en nuestros laboratorios. Tanto el transiluminador Gel Doc como el software Quantity One de BioRad®. El vídeo está en un inglés con acento hindú, pero muy fácil de seguir. Sin más dilación, os dejo con el documento multimedia:

[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=a38-lYuPhkQ[/youtube]

Este es uno de los equipos. Para los geles de poliacrilamida de toda la vida podemos tomar las fotos con un densitómetro (como un escáner) y luego están los equipos automatizados de electroforesis capilar que te suministran los datos directamente en formato digital para analizarlos tranquilamente. Eso puede ser tema para otro artículo.
Y vosotros ¿qué compuestos y aparatos utilizáis para estas «tareas cotidianas»?

Este post participa en la VI Edición del Carnaval de Biología, , que organiza @Copepodo en su blog Diario de un Copépodo y también en el VIII Carnaval de Química organizado por @lualnu10 en su blog “Caja de Ciencia”.
Logo del Carnaval de Biología
Sexta edición del carnaval de química

Escuchando: El golpeo de las teclas en el portátil ;-P

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Review del sistema Mini-PROTEAN 3 cell de Bio-Rad


Desde hace casi cuatro años me ha tocado lidiar con los geles de poliacrilamida (ver preparación de PAGEs) en multitud de variantes: desde los destinados a secuenciación a los utilizados en aparatos analizadores de fragmentos como el LiCOR 4300, de los sistemas caseros a los sistemas como el Protean II ó este mini-PROTEAN 3. De todas formas, el verdadero factor limitante está en la manipulación de la poliacrilamida y que los sistemas funcionan mejor dependiendo de ciertas condiciones y temperaturas.
En esta ocasión me gustaría hablar de este kit de Bio-Rad. El buen manejo de todo por sus reducidas dimensiones hacen que sea un buen compañero de laboratorio. Una de las grandes faenas es que salga mal la polimerización (aunque con los kits comerciales de polimerización, es bastante raro que falle) y con la consiguiente repetición de todo el proceso de limpieza y montaje. Con este sistema, los dos geles pueden estar corriendo a las 2 horas de haber empezado de cero. Pero de cero de verdad. Desde sacar las cosas de la caja hasta preparar las soluciones necesarias. Eso sí, el reducido tamaño de los geles hace que no estén destinados a análisis de bandas a gran resolución. Pero para probar están bién. Yo he hecho probatinas de técnicas para luego extrapolarlas a geles de dimensiones mayores.
En el montaje, previa limpieza de todos los componentes con etanol, hay que tener cuidado con los cristales. Los que tienen los espaciadores integrados son gruesos, pero las parejas son casi como cartulinas. No se me han llegado a romper ninguno, pero se nota la fragilidad. Os dejo el sistema de montaje para que lo veáis:

Dependiendo de la consistencia de los geles (que la proporcionará la concentración del gel en su mayoría y la calidad de las soluciones empleadas), extraer los geles de los cristales puede ser el paso más crítico por el riesgo de rotura. Siempre se pueden dejar los cristales y embeber el conjunto en las soluciones para teñir (en mi caso he utilizado nitrato de plata y bromuro de etidio como prueba), pero que no pase de la solución de fijación para no tener los cristales «manchados» para futuros geles.
Os muestro un ejemplo de geles teñidos con plata a continuación:

Ejemplo de Geles de poliacrilamida final
Geles de poliacrilamida utilizando el sistema Mini-PROTEAN 3. Pinchar en la imagen para agrandar

Como resumen, las ventajas del sistema son: la rapidez, la manejabilidad en el uso y el buen funcionamiento. Como desventajas: la fragilidad de los cristales, la poca resolución en comparación con sistemas más grandes, el número de pocillos que se originan por los peines que trae de serie y el deterioro que se produce con el paso del tiempo en las zonas de los separadores que originan fugas a la hora de polimerizar (que se pueden siempre solventar con truquitos como agarosa).
Espero que os haya gustado y, si tenéis alguna duda, comentádmela.

Escuchando: Comando Alt Suprimir

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Preparación de gel de agarosa para electroforesis

La preparación de gel de agarosa para electroforesis parece de cocinitas, pero es algo básico en un laboratorio de biología molecular.

Información sobre el gel de agarosa para electroforesis

La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. De lo que se trata es de formar una matriz inerte y no tóxica para construir geles que permitan separar moléculas de ADN mediante electroforesis, además de ser utilizada para fijar moléculas a su estructura como anticuerpos, antígenos y enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiología.

Otros usos menos extendidos son la utilización de estos geles como matrices en la reparación de tejidos dañados.
Una vez puestos en materia nos quedamos con la idea principal: separación de moléculas gracias a un entramado que lo permite. Esta separación se produce gracias a la aplicación de un campo eléctrico. Las muestras migrarán de un lado a otro dirigidas por ese campo eléctrico. Así moléculas como los ácidos nucleicos que son de polaridad negativa se dirigirán al ánodo.

Preparación de gel de agarosa para electroforesis

Para la preparación de un gel de agarosa se precisan 4 cosas:

  1. La agarosa en polvo.
  2. Tampón en el que se disuelve la agarosa y que sirve para embeber el gel y transmitir el campo eléctrico.
  3. Fuente de calor o microondas para mezclar y fundir la agarosa en el tampón.
  4. Cubeta y molde para solidificar el gel y sumergirlo en el tampón. La cubeta tiene los bornes para conectar los cables a la fuente de alimentación.

Pasos a seguir

  1. En un matraz, verter la cantidad de tampón para completar el volumen del molde a rellenar con el gel.
  2. Medir la cantidad de agarosa dependiendo de la concentración a la que se quiera obtener el gel. A más concentración, mayor resolución. Por ejemplo, un gel al 2% sería 2 gramos de agarosa en polvo disueltos en 100 ml de tampón. Como podéis comprobar, la concentración se obtienen mediante la relación peso/volumen. Sencillo.
  3. Se procede a mezclar la agarosa con el tampón y fusionar los componentes para obtener el gel. Se necesita una fuente de calor como un baño (poco recomendable si se quiere rapidez) a una temperatura que permita fundir la agarosa o un microondas, que permite realizar el proceso más rápidamente. Con la experiencia, es todo un arte dependiendo de las concentraciones y las agarosas. Pero esto es sólo a modo introductorio.
  4. Se enfría el gel para poder verterlo en la cubeta. Siempre hay que acordarse de poner unos límites con cinta para que no se disperse el gel por la mesa y el peine que formará los pocillos. En unos minutos, al enfriarse del todo, se tiene el gel polimerizado.
  5. Por último se introduce en la cubeta que contiene el tampón, a la misma concentración que el que se ha utilizado para generar el gel.

Ya sólo queda cargar las muestras y correr el gel al voltaje predeterminado (generalmente a 10 voltios por cm de gel, pero depende de las muestras, el gel y los protocolos a seguir). Luego se deberá realizar una tinción para poder ver las bandas. Existen varios métodos para la preparación de gel de agarosa para electroforesis y serán limitantes para el posterior visionado, pero eso lo comentaré en otro artículo.

El gel final se puede fotografiar y guardar la imagen. Incluso se pueden extraer bandas de interés para un posterior análisis, como podéis ver en la imagen que he tomado estos días donde estuve cortando unas banditas.

Preparación de gel de agarosa para electroforesis
Ejemplo del resultado de una preparación de gel de agarosa para electroforesis.
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