Las fotos del ADN

Estructura química del bromuro de etidio
Estructura química del bromuro de etidio

Ahora que estoy terminando de escribir la ansiada tesis doctoral, me hubiera gustado poder enseñar como he ido trabajando en el laboratorio día a día. Una de las labores cotidianas es realizar fotografías de los geles de electroforesis que contienen los fragmentos de ADN previamente amplificados mediante PCR para poder analizarlos posteriormente con más detenimiento. Esas imágenes se han podido ver en infinidad de documentales y series de televisión. Son esas fotografías en las que salen una serie de bandas que pertenecen a cada uno de los productos de PCR (aunque también pueden ser digestiones con enzimas u otro tipo de análisis a nivel molecular).
Resumiré las nociones básicas de por qué se ven las bandas de ADN gracias al bromuro de etidio (cada día en más desuso por la utilización de otros agentes intercalantes como el Sybr green, con relativo menor peligro mutagénico) y el por qué de su «iluminación» al incidir los rayos ultravioleta. Cuando se expone el bromuro de etidio (ó Bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio) a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágenico y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.

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Review del sistema Mini-PROTEAN 3 cell de Bio-Rad


Desde hace casi cuatro años me ha tocado lidiar con los geles de poliacrilamida (ver preparación de PAGEs) en multitud de variantes: desde los destinados a secuenciación a los utilizados en aparatos analizadores de fragmentos como el LiCOR 4300, de los sistemas caseros a los sistemas como el Protean II ó este mini-PROTEAN 3. De todas formas, el verdadero factor limitante está en la manipulación de la poliacrilamida y que los sistemas funcionan mejor dependiendo de ciertas condiciones y temperaturas.
En esta ocasión me gustaría hablar de este kit de Bio-Rad. El buen manejo de todo por sus reducidas dimensiones hacen que sea un buen compañero de laboratorio. Una de las grandes faenas es que salga mal la polimerización (aunque con los kits comerciales de polimerización, es bastante raro que falle) y con la consiguiente repetición de todo el proceso de limpieza y montaje. Con este sistema, los dos geles pueden estar corriendo a las 2 horas de haber empezado de cero. Pero de cero de verdad. Desde sacar las cosas de la caja hasta preparar las soluciones necesarias. Eso sí, el reducido tamaño de los geles hace que no estén destinados a análisis de bandas a gran resolución. Pero para probar están bién. Yo he hecho probatinas de técnicas para luego extrapolarlas a geles de dimensiones mayores.
En el montaje, previa limpieza de todos los componentes con etanol, hay que tener cuidado con los cristales. Los que tienen los espaciadores integrados son gruesos, pero las parejas son casi como cartulinas. No se me han llegado a romper ninguno, pero se nota la fragilidad. Os dejo el sistema de montaje para que lo veáis:

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Protocolo para geles de Poliacrilamida

Desde hace unos años estoy utilizando protocolos varios para resolver ciertos marcadores moleculares en geles de poliacrilamida. Por falta de tiempo, no he podido nunca poder hacer un vídeo explicativo para que todos vosotros pudierais ver el trabajo que se origina para este tipo de análisis. Pues he encontrado a un grupo de investigadores hindúes, que se han trabajado esos vídeos y me van a permitir mostrar los pasos básicos que se siguen. Os cuelgo dos vídeos que muestran el proceso completo a seguir. Siempre hay variaciones en cada laboratorio, como los equipos a utilizar o las disoluciones, pero en esencia esta bien explicado. Lo más curioso es el inglés-hindú. Me recuerda a Raj, uno de los protagonistas de The Big Bang Theory.
Parte 1.
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=qCTc_jTMqJo[/youtube]
Parte 2.
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=vfIYE47Ha0E[/youtube]

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