Las fotos del ADN

octubre 20, 2011, publicado en Ciencia, escrito por doctorGENoma
Estructura química del bromuro de etidio

Estructura química del bromuro de etidio

Share

Listados de primers con AmplifX

marzo 31, 2010, publicado en Ciencia, Tecnología, escrito por doctorGENoma

Hace un tiempo expliqué algo sobre esta aplicación llamada AmplifX. Indagando un poco, he logrado sacarla un poco más de provecho al solucionar un problema. Disponía de una colección de primers o cebadores para hacer reacciones prueba de PCR y las temperaturas de anillamiento para programar los termocicladores se habían extraviado con los apuntes de una antigua compañera en el laboratorio. El problema es que eran más de 100 parejas y no quería ir secuencia por secuencia analizando las temperaturas de cada uno. Sin embargo con AmplifX pude ver las Tm para cada primer y poder así diseñar los programas. En el vídeo-ejemplo que he generado a continuación, os muestro cómo se haría para un total de 10 parejas, pero se puede hacer con el número que se quiera. El único problema estriba en la colocación del orden de las secuencias y los nombres. Y siempre debe haber una tabulación entre esos datos, cosa que con una hoja de cálculo es automático ese formato entre celdas. Aquí os lo dejo.
Imagen de previsualización de YouTube
Ver vídeo en Vimeo
Espero que os haya gustado. Si tenéis dudas, comentádmelas.

Share

Tagged with:  

Amplificación del ADN: la PCR

diciembre 24, 2009, publicado en Ciencia, escrito por doctorGENoma

Ya he podido comentar como se trabaja con el material hereditario anteriormente. Mejor dicho, como se prepara para poder sacarle partido. Para poder tener varias copias de una región específica de ADN, se utiliza la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction = PCR). Este “gran invento” se lo debemos al premiado Nobel en Química (no entiendo porqué siguen en los premios Nobel sin dar el de Genética ;-S) Kary B. Mullis. Se le ocurrió realizar in vitro las condiciones necesarias para conseguir copias de fragmentos de ADN. El ADN está en forma de doble hélice. Para que se pueda amplificar cada hebra, es necesario que se rompan los enlaces existentes para que se mantenga esa estructura. Este proceso se realiza elevando la temperatura aproximadamente a 95 ºC durante un breve periódo de tiempo. Se denomina desnaturalización. Posteriormente se necesita que los cebadores (oligonúcleótidos o secuencias cortas de ADN de unos 20 nucleótidos diseñadas para que flanqueen una zona específica de ADN que se quiera amplificar) se anclen a sus secuencias complementarias. Para ello la temperatura juega un papel importantísimo, puesto que cada pareja de cebadores (siempre se habla de parejas puesto que se debe tener un primer o cebador por un lado y otro por el otro para que se amplifique el mismo fragmento por ambos lados y producir la amplificación de la zona flanqueada) hibrida (se une al ADN) a una temperatura que, generalmente, puede variar entre 45 y 65 ºC. Aunque hay protocolos en los que se utilizan variaciones de temperatura para obtener un mejor rendimiento, pero esto lo comentaré en artículos posteriores. Finalmente, se necesita una extensión de los fragmentos flanqueados por los primers gracias a la acción de una molécula llamada Polimerasa y que tiene su temperatura óptima de reacción a 72 ºC (aunque se utiliza también una temperatura óptima de 68 ºC, dependiendo de la casa que suministre la polimerasa). Por lo tanto y en resumen se tiene en todo el proceso 3 fases: desnaturalización, hibridación de los cebadores y extensión de los fragmentos. Al final de todo el programa, se introduce una fase de extensión más larga para que se termine de obtener un mayor número de copias.
Todo este proceso se realiza en los termocicladores: las reacciones se preparan en frío y los tubos o placas de reacción se depositan en estos aparatos que son programados para realizar los ciclos que he explicado antes. Un esquema de programa es el que pongo en la imagen siguiente:

En cada ciclo de amplificación, el fragmento de ADN diana aumentará en el número de copias de forma exponencial. Esto provoca que, al final de un programa básico, se obtengan aproximadamente hasta 100 millones de copias del fragmento deseado.
Las variaciones de tiempo dependen principalemente de la longitud de los fragmentos. Cuanto más tiempo mayor es el fragmento a amplificar. La clave de una buena eficiencia depende de los diseños de las reacciones de PCR que se deben ajustar a las condiciones de cada reacción.
Al principio, las polimerasas que se utilizaban no eran termorresitentes. Esto provocaba que, en cada ciclo, había que añadir polimerasa para que se pudiera extender la amplificación. Ahora se utilizan polimerasas que permiten ser añadidas en la preparación de las reacciones y se puede olvidar de ello.
Me gustaría explicarlo todo: como se diseñan los cebadores, la realización de la reacción de PCR y todos los componentes, los estudios que se pueden derivar..etc, pero igual no acabo con el artículo y creo que la base sí que la he plasmado. Si se tienen alguna duda al respecto podéis dejar un comentario o enviárme un correo. Este vídeo explica todo bastante bien con un inglés muy fácil de seguir. Incluso se observan los fragmentos que no son específicos (que no se buscan amplificar pero que se obtienen de todas formas por la hibridación de los primers)
Imagen de previsualización de YouTube
Referencia del vídeo: Essential Cell Biology, 3rd Edition. Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, & Walter

Share

Tagged with:  

Los termocicladores

noviembre 12, 2009, publicado en Ciencia, escrito por doctorGENoma

No son más que aparatos que pueden ser programados para generar ciclos de temperatura a nuestro antojo. De esta forma podremos diseñar programas específicos para poder amplificar fragmentos de ADN determinados. Simplemente son aparatos que contienen una termoplaca, donde se colocan las muestras, y que es controlada mediante un software informático.

Termociclador

Termociclador


Sin embargo, el uso de los termocicladores también es útil no sólo en procesos de PCR. Su utilidad es igual de buena en estudios con enzimas de restricción que necesitan actuar a ciertas temperaturas un determinado período de tiempo. De esta forma se controlan perfectamente las condiciones en las que sucede la reacción.

Share

Tagged with:  

AmplifX

octubre 9, 2009, publicado en Ciencia, Tecnología, escrito por doctorGENoma

Estamos ante un programa muy básico que permite simular PCRs y así permite verificar que los primers diseñados para amplificar una secuencia específica, están bien construidos. Esta aplicación permite guardar los primers a modo de base de datos. Así se pueden tener varias parejas de cebadores guardadas y probar con varios fragmentos de ADN secuenciados para probar la reacción de amplificación.

Tiene una funcionalidad añadida: informa sobre la teórica temperatura de anillamiento óptima para llevar a cabo la amplificación de forma específica. Sin embargo es mejor seguir con las indicaciones habituales que seguir esta recomendación (lo he podido comprobar en amplificaciones específicas). Así también, al añadir la pareja de cebadores, muestra un diálogo que comenta la temperatura de fusión, porcentaje de c+g o la estabilidad del extremo 3’ entre otros parámetros.
Es otra herramienta que puede facilitar algo el trabajo del laboratorio.

Share

Tagged with:  

premium wordpress themes
Weboy DoctorGenoma