Las fotos del ADN

Estructura química del bromuro de etidio
Estructura química del bromuro de etidio

Ahora que estoy terminando de escribir la ansiada tesis doctoral, me hubiera gustado poder enseñar como he ido trabajando en el laboratorio día a día. Una de las labores cotidianas es realizar fotografías de los geles de electroforesis que contienen los fragmentos de ADN previamente amplificados mediante PCR para poder analizarlos posteriormente con más detenimiento. Esas imágenes se han podido ver en infinidad de documentales y series de televisión. Son esas fotografías en las que salen una serie de bandas que pertenecen a cada uno de los productos de PCR (aunque también pueden ser digestiones con enzimas u otro tipo de análisis a nivel molecular).
Resumiré las nociones básicas de por qué se ven las bandas de ADN gracias al bromuro de etidio (cada día en más desuso por la utilización de otros agentes intercalantes como el Sybr green, con relativo menor peligro mutagénico) y el por qué de su «iluminación» al incidir los rayos ultravioleta. Cuando se expone el bromuro de etidio (ó Bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio) a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágenico y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.

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Listados de primers con AmplifX

Hace un tiempo expliqué algo sobre esta aplicación llamada AmplifX. Indagando un poco, he logrado sacarla un poco más de provecho al solucionar un problema. Disponía de una colección de primers o cebadores para hacer reacciones prueba de PCR y las temperaturas de anillamiento para programar los termocicladores se habían extraviado con los apuntes de una antigua compañera en el laboratorio. El problema es que eran más de 100 parejas y no quería ir secuencia por secuencia analizando las temperaturas de cada uno. Sin embargo con AmplifX pude ver las Tm para cada primer y poder así diseñar los programas. En el vídeo-ejemplo que he generado a continuación, os muestro cómo se haría para un total de 10 parejas, pero se puede hacer con el número que se quiera. El único problema estriba en la colocación del orden de las secuencias y los nombres. Y siempre debe haber una tabulación entre esos datos, cosa que con una hoja de cálculo es automático ese formato entre celdas. Aquí os lo dejo.
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=MbHPOt_Shnc[/youtube]
Ver vídeo en Vimeo
Espero que os haya gustado. Si tenéis dudas, comentádmelas.

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Amplificación del ADN

Amplificación del ADN: la PCR

La amplificación del ADN mediante PCR no podía faltar en este blog. Ya he podido comentar como se trabaja con el material hereditario anteriormente. Mejor dicho, cómo se prepara para poder sacarle partido. Para poder tener varias copias de una región específica de ADN, se utiliza la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction = PCR).

Comienzos de la PCR

Este «gran invento» de la PCR se lo debemos al premiado Nobel en Química de 1993 Kary B. Mullis. Se le ocurrió realizar in vitro las condiciones necesarias para conseguir copias de fragmentos de ADN.

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Los termocicladores

No son más que aparatos que pueden ser programados para generar ciclos de temperatura a nuestro antojo. De esta forma podremos diseñar programas específicos para poder amplificar fragmentos de ADN determinados. Simplemente son aparatos que contienen una termoplaca, donde se colocan las muestras, y que es controlada mediante un software informático.

Termociclador
Termociclador

Sin embargo, el uso de los termocicladores también es útil no sólo en procesos de PCR. Su utilidad es igual de buena en estudios con enzimas de restricción que necesitan actuar a ciertas temperaturas un determinado período de tiempo. De esta forma se controlan perfectamente las condiciones en las que sucede la reacción.

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AmplifX

Estamos ante un programa muy básico que permite simular PCRs y así permite verificar que los primers diseñados para amplificar una secuencia específica, están bien construidos. Esta aplicación permite guardar los primers a modo de base de datos. Así se pueden tener varias parejas de cebadores guardadas y probar con varios fragmentos de ADN secuenciados para probar la reacción de amplificación.

Tiene una funcionalidad añadida: informa sobre la teórica temperatura de anillamiento óptima para llevar a cabo la amplificación de forma específica. Sin embargo es mejor seguir con las indicaciones habituales que seguir esta recomendación (lo he podido comprobar en amplificaciones específicas). Así también, al añadir la pareja de cebadores, muestra un diálogo que comenta la temperatura de fusión, porcentaje de c+g o la estabilidad del extremo 3’ entre otros parámetros.
Es otra herramienta que puede facilitar algo el trabajo del laboratorio.

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Lo maravilloso de las micropipetas


El ajuar de laboratorio es siempre escaso. Y el cansancio que conlleva intentar mejorar esas condiciones es proporcional al material disponible: cuanto más y mejor material se tiene, menos cansancio se acumula. Esto que parece una bobada, cuando se trata de estar haciendo reacciones de PCR durante toda una semana para poder mapear genes…pues deja de ser un simple pipeteo a convertirse en un destroza hombros, antebrazos y pulgares. Y, si además para ver mejor el alicuoteo para cada muestra, el proceso se debe hacer de pie…pues hay que añadir cansancio en las piernas y la espalda. Vamos, que acabas el día como si hubieras trabajado en la obra, con el agotamiento mental añadido de estar concentrado para no pifiarla a la hora de pipetear. Para los que no se hacen una idea: una tanda de PCR normal que realizo yo en el laboratorio consiste en 105 muestras en las que, en cada una de ellas, hay que añadir un volumen determinado de dNTPs, buffer de reacción para la polimerasa, Taq polimerasa, Agua estéril Mili Q y el DNA correspondiente. Todo el mundo científico se vale de la maravillosa ayuda de las casas comerciales que permiten no tener que hacer a mano los búfferes de reacción. Y los dNTPs junto con el búffer y el agua se puede juntar para hacer un mix. Incluso si tienes unos cebadores que vayan bien, puedes incluirlos en el mix. Pero, cuando se trata de mapear genes y tienes que hacer la reacción para cada uno de los 105 individuos para ese gen determinado, pues, al menos, necesitas pipetear…unas 210 veces si haces el mix con primers incluidos y no tienes una micropipeta. A eso hay que añadir los pipeteos de la preparación de los mix de reacción. Todo esto lleva un gasto de tiempo bastante grande. Pero, si se quiere estar seguro de que vaya una concentración determinada de cada pareja de cebadores en cada muestra, pues el número de pipeteos se duplica. Todo esto lo cuento para un científico que no tiene la posibilidad de tener una micropipeta multicanal.
A eso quería yo llegar. Para los que no lo sepan, una pipeta multicanal es, como su nombre indica, una micropipeta que tiene muchos canales. Dependiendo del modelo, las hay de 8 ó 12 canales. Por lo tanto, cada vez que accionamos el émbolo para dejar soltar la alícuota pertinente en una batería de muestras, haremos el mismo trabajo reducido en una octava parte como poco. Vamos, que se puede hacer lo mismo que con la micropipeta normal pero 8 veces más rápido (si tiene ocho canales) ó 12 veces más rápido, como es el caso de la micropipeta que dispongo.
A eso de la reducción de esfuerzo hay que añadir una reducción de error de pipeteo, ya que cada vez que se acciona el mecanismo la succión y vertido es el mismo en los 12 pocillos a la vez.
Pero hay algo más. El cansancio mental también se reduce puesto que no se tiene que estar tan concentrado (esto no significa que no haya que estarlo para que todo vaya bien, eh!) a la hora de controlar los pipeteos.
Si a esto sumamos la pericia de cada investigador a la hora de hacer mixes, la reducción del número de pipeteos se reduce hasta un número de…¡¡36 pipeteos por cada tanda de 105 reacciones!!.
Todo esto también tiene un fallo: la captura de cada punta con las micropipetas multicanal. Cada casa comercial que fabrique este tipo de pipetas, produce unas puntas específicas que permite un mejor anclaje de éstas. Sin embargo, en la gran mayoría de los laboratorios se piden puntas a granel para todas la pipetas y pedir un cargamento a mayores de esas puntas tan específicas conlleva un gasto bastante grande. Siempre que se usan puntas no especiales, se suele tener que apretar un poco cada punta para que tome el volumen correcto. Esto hay que hacerlo con cuidado para preservar las condiciones de esterilidad. Pero cuando ya lo has hecho unas cuantas veces, la maña bate por goleada a la falta de presupuesto.
En fin, que todo laboratorio que tenga que manejar un número considerable de muestras, debería tener unas cuantas micropipetas multicanal. Tan sólo un consejo más: cada pipeta debería ser personal en intransferible. Para evitar continuas descalibraciones.

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