Las fotos del ADN

Estructura química del bromuro de etidio
Estructura química del bromuro de etidio

Ahora que estoy terminando de escribir la ansiada tesis doctoral, me hubiera gustado poder enseñar como he ido trabajando en el laboratorio día a día. Una de las labores cotidianas es realizar fotografías de los geles de electroforesis que contienen los fragmentos de ADN previamente amplificados mediante PCR para poder analizarlos posteriormente con más detenimiento. Esas imágenes se han podido ver en infinidad de documentales y series de televisión. Son esas fotografías en las que salen una serie de bandas que pertenecen a cada uno de los productos de PCR (aunque también pueden ser digestiones con enzimas u otro tipo de análisis a nivel molecular).
Resumiré las nociones básicas de por qué se ven las bandas de ADN gracias al bromuro de etidio (cada día en más desuso por la utilización de otros agentes intercalantes como el Sybr green, con relativo menor peligro mutagénico) y el por qué de su «iluminación» al incidir los rayos ultravioleta. Cuando se expone el bromuro de etidio (ó Bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio) a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágenico y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.

Distorsión de la hélice de ADN por la inserción del bromuro de etidio entre las pares de bases AT (adenina y timina) y TA. Imágenes procedentes de sandwalk.blogspot.com y artículo en JACS de Reha et al., 2003.

Estructura química del Sybr green
Estructura química del Sybr green

Desde que lanzaron el conocido Sybr green los laboratorios Invitrogen®, parecía que el miedo que siempre nos metían a todos los científicos sobre lo malo que era este compuesto desaparecería con el nuevo «invento verde». Esta molécula se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla energéticamente a los ácidos nucleicos que lo forman, de manera que se incrementa notablemente su tasa de emisión fluorescente. Este fenómeno se conoce como transferencia de energía mediante resonancia de fluorescencia. El complejo resultante ADN-SYBR Green presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el pico de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, de ahí su nombre). Ese «miedo» sobre la genotoxicidad del bromuro de etidio que nos intercalaban en nuestras mentes no está muy bien determinado. Como se explicó en 2006 en rrresearch.fieldofscience.com por Rosie Redfield, esa posibilidad mutagénica no está demostrada y las cantidades para que ocurra son increíblemente elevadas. Casi todas las marcas que lo distribuyen muestran los resultados del test de Ames que demuestran el pase de este Sybr green como no mutagénico. Sin embargo, parece ser que existen estudios (ver artículo anteriormente enlazado) en los que se demuestra una mayor toxicidad en ratones con este compuesto que con el bromuro de etidio. Lo malo es que no se suelen explicar todos los pros y contras de cada compuesto como se debería. Y los agentes de ventas de las casas que comercializan estos compuestos tampoco conocen todo sobre ellos. Y no tienen por qué ser completamente transparentes si omitiendo datos consiguen ventas. Lo importante no es echar culpas si no ser precavidos e informarse debidamente.

Una vez dicho todo esto sobre lo que esconden nuestros geles teñidos, quería mostrar que los investigadores del centro TNAU Genomics & Proteomics parece que me han leído el pensamiento y han elaborado un vídeo sobre esta toma de imágenes. Lo bueno es que es exactamente el mismo equipo que usamos en nuestros laboratorios. Tanto el transiluminador Gel Doc como el software Quantity One de BioRad®. El vídeo está en un inglés con acento hindú, pero muy fácil de seguir. Sin más dilación, os dejo con el documento multimedia:

[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=a38-lYuPhkQ[/youtube]

Este es uno de los equipos. Para los geles de poliacrilamida de toda la vida podemos tomar las fotos con un densitómetro (como un escáner) y luego están los equipos automatizados de electroforesis capilar que te suministran los datos directamente en formato digital para analizarlos tranquilamente. Eso puede ser tema para otro artículo.
Y vosotros ¿qué compuestos y aparatos utilizáis para estas «tareas cotidianas»?

Este post participa en la VI Edición del Carnaval de Biología, , que organiza @Copepodo en su blog Diario de un Copépodo y también en el VIII Carnaval de Química organizado por @lualnu10 en su blog “Caja de Ciencia”.
Logo del Carnaval de Biología
Sexta edición del carnaval de química

Escuchando: El golpeo de las teclas en el portátil ;-P

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Practicando con la química aislando la cocaína

Aunque sea tabú para muchos, he podido leer en un gran blog como es el de Apuntes científicos desde el MIT la ciencia que hay detrás de la obtención de cocaína. Marca el protocolo a seguir si se quiere obtener 1Kg de cocaína a partir de unos 100Kg de hojas de coca. Muy interesante, sobre todo desde el punto de vista químico. Os lo dejo a continuación a modo de cita:

De la hoja de coca a la cocaína
Si como hacen algunos poblados indígenas las secas y metes en tu boca junto con una bola de fragmentos calcáreos de caracola de mar quemada y triturada, poco a poco irás extrayendo e incorporando a tu organismo un alcaloide llamado cocaína que eliminará tu sensación de hambre, sed, cansancio, dolores, y te mantendrá estimulado durante todo el día.
Pero también puedes recordar las clases de química de productos naturales (disciplina que busca identificar y extraer de la naturaleza sustancias con aplicaciones industriales, agroalimentarias, farmacológicas…) y llevar a cabo un proceso de extracción química ligeramente más elaborado:
Recolectas 100 Kg de hojas de coca (necesitarás unas 6000 plantas) y te pasas media hora triturándolas.
Luego añades 100 Kg de cal (óxido de calcio) y 200 Kg de sal común, y vas pisoteándolas durante una hora para ir rompiendo las paredes de las células vegetales y dejar libres las moléculas de cocaína.
Tu objetivo químico entonces será separar dichas moléculas de todo el resto de componentes en esos grumos sucios de color verde oscuro. En química existen gran cantidad de técnicas de separación, pero una de las más utilizadas – especialmente en los laboratorios de productos naturales- es jugar con la polaridad de las moléculas y su afinidad relativa en ciertos solventes: ir añadiendo diferentes tipos de líquidos que disuelven unas sustancias y no otras, y quedándote en cada caso la fracción que te interese.
Por ejemplo, disolventes orgánicos como la gasolina lo disuelven casi todo: introduces tu mezcla de hojas de coca, cal y sal en un bidón con 120 litros de gasolina, lo remueves durante dos horas, lo filtras, y ya puedes tirar los restos sólidos a la basura. Los componentes de la futura pasta de coca -junto con muchas otras sustancias- se habrán quedado en la fase líquida.
Pero tú no quieres la gasolina para nada. Le añades 10 litros de agua con 50 miligramos de ácido sulfúrico concentrado, remueves enérgicamente durante 10 minutos para que todas las moléculas de la mezcla entren en contacto entre sí, y lo dejas reposar hasta que la fase acuosa y orgánica se separen debido a su diferente densidad. Estás haciendo una clásica decantación líquido-líquido.
Conoces la polaridad de las moléculas de cocaína, y sabes que son mucho más afines a la mayor polaridad de la pequeña fase acuosa que queda en el fondo del recipiente. Coges un tubito, sitúas un extremo en el fondo, y succionas para traspasar a otro recipiente la mezcla transparente de agua, ácido, pasta de coca, sales, y todavía muchas otras sustancias. Eso hay que limpiarlo.
Para ello vas añadiendo poco a poco 1 kg de permanganato potásico. Este compuesto neutralizará los restos de gasolina, cal y sal, y hará que se formen unos grumos sólidos de color marrón oscuro.
Los filtrarás, y te quedarás de nuevo con el líquido transparente que irá goteando dentro de otro recipiente.
Allí es donde se encuentra la mayor parte del alcaloide, disuelto gracias a que el pH es todavía considerablemente ácido.
Entonces vuelves a jugar con las polaridades de las moléculas y su solubilidad: Vas añadiendo poco a poco sosa cáustica para ir neutralizando la acidez de la mezcla y disminuir su polaridad, hasta que una sustancia blanquecina empiece a precipitar.
La filtras. Esa pasta contiene un 90% de cocaína.
Si coges un poquito con el dedo y te la colocas sobre las encías, se anestesiará la zona dejando la misma sensación extraña que cuando el dentista te duerme un área de tu boca.
Lo dejarás secar, y si el proceso ha funcionado correctamente tendrás 1 Kg de pasta de coca lista para ser vendida a narcotraficantes. A ellos sólo les quedará el paso de añadir acetona para limpiar las impurezas de químicos y dejar la cocaína en un estado de polvo ya preparado para su adulteración y posterior uso.

Curiosa la forma de aislar el alcaloide ¿verdad?. Espero que os haya gustado.

Enlace al artículo original

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