Plásmido bacteriano

Las enzimas de restricción

A lo largo de estas semanas estoy volviendo a trabajar con enzimas de restricción y, antes de publicar un artículo sobre ciertas aplicaciones, será buena idea explicar un poco sobre el tema.
Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia. Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay un amplísimo catálogo de enzimas de restricción (podéis ver un ejemplo en el listado de Takara) y los usos destinados son varios: para la realización de mapas físicos (hablamos de ADN, no de cordilleras XDD), huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.
Con un ejemplo queda todo más claro: una enzima muy típica es Alu I que reconoce la secuencia AGTC y corta la doble hélice del ADN entre la Guanina y la Timina. Su actuación sería darse un paseo por toda la hebra de ADN en búsqueda de esa diana. En el momento que la encuentra, se ancla y corta, obteniéndose dos fragmentos. Si no hubiera esa secuencia diana, no corta y el fragmento de ADN de doble cadena que teníamos quedará igual que antes. Si os dais cuenta, es un buen método para diferenciar individuos. La variación de nucleótidos entre distintos individuos puede observarse de esta forma sin necesidad de secuenciar.
No se aplican estas enzimas a la totalidad del ADN genómico, ya que se obtendrían multitud de bandas que no se podrían distinguir bien. Se amplifican, mediante PCR, ciertos lugares específicos del ADN para que las dianas de restricción permitan obtener unos resultados claros para su posterior análisis.
Para los que trabajamos en un laboratorio esto que acabo de explicar es como usar el cuchillo en las comidas, pero ya he visto que hay cierto interés en ciertas aplicaciones de uso en el laboratorio y pronto haré una review de herramientas que facilitan el estudio mediante enzimas de restricción.
Por ahora, para que no sea un rollo lo que he explicado, os dejo con un vídeo (es una animación en 3D) sobre como actúa una enzima de restricción para clonar un fragmento de ADN. Recordad lo que es la clonación. Es una de las técnicas de ingeniería genética más comunes en los laboratorios de biología molecular. Se puede ver como la actuación de la enzima proporciona unos extremos en el plásmido (son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Plásmido bacterianoEstán presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula) que son complementarios al corte hecho a un fragmento de ADN que queremos insertar con la misma enzima de restricción. Por último serán unidos los extremos por otra enzima llamada ligasa. Así se puede incluir como si formara parte del plásmido y obtener copias idénticas del fragmento de interés al replicarse la bacteria.
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Espero que os haya gustado.

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Amplificación del ADN

Amplificación del ADN: la PCR

La amplificación del ADN mediante PCR no podía faltar en este blog. Ya he podido comentar como se trabaja con el material hereditario anteriormente. Mejor dicho, cómo se prepara para poder sacarle partido. Para poder tener varias copias de una región específica de ADN, se utiliza la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction = PCR).

Comienzos de la PCR

Este «gran invento» de la PCR se lo debemos al premiado Nobel en Química de 1993 Kary B. Mullis. Se le ocurrió realizar in vitro las condiciones necesarias para conseguir copias de fragmentos de ADN.

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El ADN

El ácido desoxirribonucléico ó ADN es una molécula de tipo polímero ya que está compuesta por una cadena de monómeros unidos entre sí. Cada monómero se llama nucleótido, que a su vez está constituído por tres componentes: una base nitrogenada, una pentosa (azúcar de cinco carbonos) y un fosfato.
La base del código genético la dictan las bases nitrogenadas. Son cuatro en el ADN Adenina y Guanina (A y G), que son bases púricas y Citosina y Timina (C y T), que son bases pirimidínicas. En el ARN la Timina deja lugar a la base llamada Uracilo (U). Por lo tanto existen cinco tipos de bases nitrogenadas. La combinación de las bases nitrogenadas provoca la generación del código genético. Por eso se pueden ver que las secuencias de ADN son del tipo «AACTGGGTCATGCGAA».

Estructura molecular del ADN
Estructura molecular del ADN

A forma de repaso, quería recalcar que las bases nitrogenadas se unen a los azúcares (ribosas en el caso del ADN) y dan lugar a nucleósidos. Posteriormente, esos nucleósidos al unirse los fosfatos dan lugar a los nucleótidos. Era para recordar ese anuncio de una crema que anunciaba el descubrimiento de una molécula llamada Adenosina. Es para reirse. Que es la Adenosina más que el nucleósido que tiene la Adenina como base nitrogenada. Pero, qué se le va a hacer. Finalmente, el ADN (se puede extrapolar igualmente al ARN si se recuerda que las Timinas son Uracilos) no es más que la polimerización de nucleótidos que se unen mediante enlaces fosfato. A lo largo de la hebra van quedando los residuos de fosfato, con carga negativa, que confieren el carácter ácido a la molécula.
Hasta ahora se ha hablado de la formación de una hebra de ADN. Pero la forma básica de nuestro material hereditario no se encuentra un una sola hebra. Dos de estas hebras, que son complementarias por las uniones entre las bases púricas y las pirimidínicas (A con T y C con G), forman la doble hélice de ADN. Tiene un tamaño de 20 Armtrongs de diámetro y da una vuelta completa cada 34 Armstrongs.
Doble hélice de ADN
Doble hélice de ADN
Hay otras formas de hélice, pero esta es la forma natural y estable que se encuentra en la mayoría de las células. Posteriormente esta doble hélice sufrirá empaquetamientos sucesivos que daran lugar a su compresión y formación de los distintos cromosomas.
Bueno, espero que haya sido de utilidad. Si tenéis dudas, comentadlas e intentaré aclararlas todas.

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Manipulación de muestras de ADN

A la hora del manejo de las muestras de ADN hay que tener varios factores en cuenta: primero la esterilidad y pureza del lugar donde se depositan. Evidentemente las muestras de ADN no se almacenan en un tubo cualquiera. El vial destinado para ello debe ser estéril y haber sido autoclavado previamente. Parece una redundancia, pero no es así. Los viales vienen de las empresas comercializadoras con un certificado de esterilidad. En un laboratorio suele haber un grupo amplio de investigadores. Cada uno con sus manías y sus protocolos de esterilización. Lo usual es que se repartan viales en otros recipientes para que cada uno tenga su material. Y esos contenedores deben ser de un material, como el vidrio, que resista altas temperaturas. De este modo no hay que preocuparse tampoco de cómo han sido rellenados los recipientes con los viales ya que, antes de pasar al investigador, son autoclavados: esterilizados mediante la acción de vapor de agua a cierta presión durante un tiempo determinado.
Así también pasan por el mismo proceso todos los materiales desechables que se utilicen como puntas de micropipetas, tubos de ensayo, probetas u otros recipientes y viales.
Algo que no he comentado es la situación del personal del laboratorio. Se deben usar guantes en todo momento. Esto es debido a que en las manos tenemos unas enzimas llamadas DNAsas que digieren el ADN. El simple contacto de los viales y/o las muestras con las DNAsas sería fatal. Otra precaución que se toma siempre es mantener las muestras en frío siempre y cuando los protocolos de manipulación no indiquen lo contrario. El recipiente de poliestireno relleno de hielo picado es otro compañero más en el laboratorio.
Dependiendo del tipo de muestras y del nivel de purificación que se necesite para su procesado y estudios posteriores, hay que almacenar el ADN diluído desde simple Agua estéril y filtrada (Agua MiliQ) hasta en buffers (soluciones tamponadas) específicos que permitan una mayor eficiencia en el análisis. También puede que necesiten seguir algún protocolo de purificación mediante técnicas tradicionales o con kit especiales para ello.
Por último, el almacenamiento de las muestras debe realizarse a 4ºC si se van a utilizar en periodos de tiempo medio (unas semanas) o a -20ºC si se piensa almacenar para análisis no a corto plazo. Nunca se deben congelar y descongelar muy sucesivamente las muestras porque los cristales de hielo formados en la congelación pueden romper las hebras de ADN, empeorando rendimientos.
Seguiré con más lecciones de laboratorio pronto.

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Extracción de ADN

Lo más habitual en cualquier laboratorio de genética es extraer el ADN de cualquier tejido o superficie. En mi caso he podido extraer ADN de hojas de plantas, de semillas, de tejido de lagarto, de lodo, de sangre…e incluso de los compuestos obtenidos de un tanque de fermentación.
Hace unos años era necesario preparar para cada ocasión una serie de tampones o buffers para poder extraer el material hereditario. Y cada disolución tenía que prepararla cada uno. Ahora todo es muy sencillo. Existen kits de extracción para cada tipo de tejido o muestra a analizar. La utilización de estos kits tienen sus pros y sus contras: generalmente la eficiencia de la extracción (la cantidad de ADN obtenido por extracción) suele ser bastante mayor con los métodos tradicionales. Sin embargo, la pureza del ADN aislado es mayor cuando se usan los kits. Dependiendo para qué se vaya a utilizar el ADN y el tipo de estudio, será mejor tener más ADN y menos puro ó viceversa. Las nuevas tecnologías suelen «funcionar» mejor cuanto más limpia sea la extracción, ya que en muchas ocasiones recomiendan purificarlo.

kit de extracción de ADN
kit de extracción de ADN

A modo informativo y dependiendo de la muestra, el tiempo para extraer ADN oscila entre 30 minutos y una hora. Cuantas más muestras se tengan a extraer a la vez, mayor será el tiempo.
Cuando ya se tiene el vial con el ADN disuelto en el tampón de elución, siempre hay que hacer una cuantificación. Con aparatos como el NanoDrop, la cantidad de ADN utilizado para cuantificar es de tan sólo 1 microlitro. Para hacerse una idea, es poco más de lo que ocupa la impresión del punto en el teclado de un ordenador. Hay ocasiones en que existen problemas con las mediciones y se opta por seguir el método tradicional que consiste en hacer un gel de agarosa a una concentración del 0,8% y realizar una electroforesis de todas las extracciones. Posteriormente, la imagen que se obtiene en el transiluminador de rayos ultravioleta (siempre que se utilicen marcajes como el bromuro de etidio o SybrGreen) se utiliza para hacer un cálculo estimado de la concentración de ADN gracias a la extrapolación que nos permite el marcador de fragmentos de ADN (un marcador de ADN en escalera (DNA ladder) no es más que un fragmento de ADN el cuál ha sido cortado de forma que se obtienen bandas de un tamaño conocido), ya que sí que sabremos la concentración cargada en el gel de ese marcador.
ejemplo de gel de electroforesis en gel de agarosa. Las concentraciones de las muestras se observan en microgramos/microlitro
ejemplo de gel de electroforesis en gel de agarosa. Las concentraciones de las muestras se observan en microgramos/microlitro

Bueno, aquí he dejado unas nociones básicas de una de las primeras partes del trabajo en un laboratorio de Genética. Espero que os haya gustado.

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Hablando con Pilar Iniesta

De nuevo un podcast más que interesante en «Hablando con científicos» de cienciaes.com. En esta ocasión la directora del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II en la Universidad Complutense de Madrid hace un repaso de la molécula más importante a nivel molecular (desde mi punto de vista): el ADN. De forma clara y concisa se explica los pormenores del estudio del ácido desoxirribonucleico y el estudio del que derivó el nuevo premio Nobel de medicina. Bueno. No quiero entrar al trapo. «Nobel en Medicina». Espero que en el futuro se de cuenta el mundo entero de las diferencias entre Biología y Medicina. La incultura llega hasta la cima de los cultos.

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Nueva técnica de detección de daño genético en espermatozoides

Hay buenas noticias para la supervivencia de la especie. En el trabajo realizado en la Unidad de Genética del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, se describe un nuevo método para evaluar la fragmentación del ADN del espermatozoide humano. Esta técnica podría tener importantes aplicaciones en el campo de la fertilidad humana y la patología andrológica.
La base de la técnica que utilizan es la siguiente: los espermatozoides se lisan con detergentes y sales en altas concentraciones y el ADN liberado se somete a una electroforesis. Por la acción de un campo eléctrico, los fragmentos de ADN roto, se desplazan y generan una imagen parecida a un cometa, con un núcleo y una cola de fragmentos. La cantidad de daño en el ADN se cuantifica midiendo la longitud y la densidad de la cola del cometa. Cuanto más larga y/o densa es esta cola, mayor es el daño de ADN.

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La Mitosis

La mitosis es la división celular con la repartición del material hereditario en células eucariotoas. Las fáses principales son: Interfase, Profase, Anafase, Telofase, Metafase y Cariocinesis.
Esquema de la Mitosis
La división de las células eucarióticas es parte de un ciclo vital continuo, el ciclo celular, en el que se distinguen dos períodos mayores, la interfase, durante la cual se produce la duplicación del ADN, y la mitosis, durante la cual se produce el reparto idéntico del material antes duplicado. La mitosis es una fase relativamente corta en comparación con la duración de la interfase.

Interfase

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