ADN circulante : toda la información

Tras un año y medio centrado en la investigación sobre ADN circulante es hora de explicar de forma clara todo sobre esta herramienta que está revolucionando el mundo científico y, más específicamente, la Oncología.

Sin entrar en detalles demasiado técnicos y soporíferos, aquí está toda la información sobre el ADN circulante.

ADN circulante ¿qué es?

Como definición, el ADN circulante son fragmentos de ácido desoxirribonucleico que se encuentran fuera del espacio intracelular. Estos fragmentos son en realidad desechos celulares provenientes de la apoptosis o muerte celular.

Su localización será, por tanto, los espacios extracelulares y está disponible para su análisis gracias a las biopsias líquidas.

Aunque en este artículo nos centraremos en el ADN, es lógico deducir que podemos hablar mejor de ácidos nucleicos circulantes: también se pueden encontrar distintas moléculas de ARN.

Las biopsias líquidas más importantes son la sangre y la orina puesto que son poco invasivas. En el caso de la sangre, nuestro ADN diana se encuentra en el plasma sanguíneo

Otras biopsias líquidas como son el líquido celaforraquídeo o zonas más espécificas del cuerpo que requieran una intervención especial no son tan queridas por los pacientes.

Tipos de ADN circulante

Puede tener dos naturalezas:

1. ADN circulante normal: perteneciente a fragmentos de células normales.
2. ADN circulante tumoral: perteneciente a fragmentos de células tumorales.

Es importante diferenciar los dos tipos puesto que en ciencia siempre suele hablarse de ctDNA (cell tumor DNA) o ADN de células tumorales y cfDNA, ADN libre (cell free DNA), que engloba a ambos tipos de ADN circulante.

No es de más recordar que puede incluirse en ese ADN circulante normal el ADN circulante fetal, que se utiliza para ciertas pruebas prenatales actuales y que están tomando peso en muchos laboratorios de análisis.

Ventajas e inconvenientes del ADN circulante

Ventajas

La principal ventaja incide en los pacientes o donantes. La obtención se realiza a partir de los espacios extracelulares. Las biopsias líquidas como la sangre y la orina son muestras de fácil acceso, siendo las obtenciones poco invasivas.

La extracción de sangre o la toma de muestras de orina están dentro de los procedimientos comunes de cualquier servicio sanitario y por tanto no hay que formar de nuevo al personal que maneja las muestras.

Los viales o tubos en los que se almacenan pueden ser los convencionales para cada muestra. Siempre y cuando se siga el protocolo específico para la obtención del ADN circulante.

A nivel de investigación, la recolecta de muestras es relativamente sencilla. Más aún si se dispone de instituciones como los Biobancos que pueden tener stock de donaciones de interés.

Ya lo veremos más adelante, pero se trata de un biomarcador muy útil para la detección del cáncer y para hacer un seguimiento de la enfermedad.

Inconvenientes

El primer inconveniente es que existen hoy en día viales específicos para tener un mejor rendimiento y calidad del material hereditario extra celular, pero son muy caros.
Existen estudios que demuestran la utilidad de dichos viales, pero las casas comerciales no son muy objetivas al respecto.

Los métodos de extracción son caros. Es una herramienta nueva por lo que las casas comerciales aprovecharán sobremanera ofrecer productos que supongan un gran beneficio.

Además, la muestra de ADN circulante es preciada en tanto en cuanto a que los volúmenes y concentraciones finales obtenidas son pequeños. Es un diamante, y no solo por su valía.

La cuantificación del ADN circulante es un factor limitante. Dependiendo de la cantidad de fragmentos purificados, cuantificar dicho ADN puede ser todo un desafío.

Las técnicas de espectrofotometría convencionales no suelen ser eficientes y hay que pasar a análisis mediante equipos como TapeStation o PCR cuantitativa.

Anteponiéndome al análisis, puedo decir que también puede ocurrir que los niveles de ADN circulante no sean los esperados según lo que se quiera saber.

Cómo extraer el ADN circulante

La extracción y purificación del ADN circulante se realiza mediante diversos kits comerciales. Cada kit tendrá unas características y debe depender de las exigencias de cada laboratorio y de la disponibilidad de muestra.

De esta forma, hay kits de extracción que permiten obtener el ADN de muestras de plasma y orina de diversos volúmenes y otros que están restringidos a ciertas cantidades de muestra madre debido a su tecnología.

Unos kits dan un mayor rendimiento que otros y existen kits que proporcionan una gran calidad de la muestra en general. También hay kits cuya fase de purificación puede ser automatizada y otros que es sólo manual.

He utilizado varios, pero no voy a entrar en cuál kit recomendaría. Pero para discutir sobre ello puedes animarte a comentar y seguro que el debate será amplio.

Análisis del ADN circulante

Consideraciones previas

Los análisis que se pueden realizar son muchos. Todos depende de la información que se quiera obtener.

Pero sí tenemos que tener cuidado son con los factores preanalíticos de las muestras de sangre recogidas en viales con EDTA. O la previa congelación a la separación del plasma. La degradación de las células que se encuentran allí provocaría la liberación de demasiados ácidos nucleicos.

Así también hay que tener claro no utilizar viales con heparina puesto que inhiben las reacciones de PCR.

Tecnologías genómicas de análisis

Aquí enumero algunas de las tecnologías de análisis. Este mundo es muy dinámico y seguro que iré añadiendo más con el tiempo:

1. Cariotipado digital: es una técnica en la que se utiliza en ADN circulante para calcular las variaciones en el número de copias (CNVs) de ciertas regiones del genoma. Estas CNVs son determinantes a la hora de identificar un cáncer.
2. Personalized analysis of rearranged ends (PARE): esta técnica de detección de reordenamientos cromosómicos se ha trasladado a este ácido nucleico circulante con la ayuda de la secuenciación masiva.
3. Metilación del ADN: la detección de los distintos patrones de metilación mediante el tratamiento con bisulfito permite un análisis para detectar progresiones tumorales.
4. PCR cuantitativa (qPCR): en la actualidad, es uno de los estudios básicos. Mediante la selección de cebadores o primers dirigidos a detectar marcadores para los distintos tipos de cáncer nos pueden informar de la presencia de cáncer e incluso el estadio en el que se encuentra.
5. Digital droplet PCR (ddPCR): una técnica basada en PCR que se utiliza por su mayor sensibilidad al adecuarse a las bajas concentraciones del ADN circulante y que tiene aplicaciones similares a la PCR cuantitativa.
6. BEAMing: un conjunto de técnicas que permiten exprimir la información que nos da este material extracelular.
7. CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)
8. Tagged AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq): tanto este como el anterior se basan en secuenciación masiva utilizando tecnologías tipo barcoding.
9. Safe-Sequencing (Safe-Seq)
10. Duplex sequencing
11. Integrated Digital Error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-Seq

Aplicaciones en Biomedicina

Detección del cáncer

La comparación de los niveles de este ADN circulante lo convierte en un biomarcador de la presencia de células tumorales.

Dependiendo del tipo de cáncer, se ha podido observar la relación directa entre la aparición de tumores y el aumento de los niveles de ADN circulante tumoral.

Dichos niveles pueden determinarse por cuantificación, cuyos métodos más comunes son la qPCR y la ddPCR.

Seguimiento del cáncer

Así como es posible detectar la presencia de cáncer también nos permite hacer un seguimiento de la enfermedad.

Cuando un paciente enfermo de cáncer ha sido sometido a algún tratamiento como puede ser quimioterapia, radioterapia o cirugía, se debe observar una disminución del ADN circulante tumoral.

Así, si ocurre una recidiva, estos niveles aumentarán y podrán ser detectados gracias a la recogida de biopsias líquidas durante el seguimiento después del tratamiento.

Conclusiones

Los estudios basados en el ADN circulante están a una simple extracción de sangre. No hay que pasar por biopsias invasivas. Las biopsias líquidas están convirtiéndose en potentes herramientas para la lucha contra el cáncer.

El ADN circulante es una herramienta muy útil tanto para la detección como el seguimiento del cáncer. Dependerá del tipo de cáncer para tener más o menos datos acerca de la enfermedad.

Los procedimientos de obtención de las muestras madre para extraer el ADN circulante son sencillos, pero la purificación y consecuente cuantificación pueden encarecer el estudio oncológico.

El amplio abanico de herramientas tecnológicas que se nos ofrece en la actualidad hacen que el ADN circulante sea un caramelo para el avance en el conocimiento científico oncológico.

En mi opinión todo buen laboratorio dedicado a la Biomedicina debería disponer de un área dedicada a dichas tecnologías. De nuevo la naturaleza nos pone en bandeja otra herramienta con la que podamos combatir una de nuestras grandes preocupaciones.