Las enzimas de restricción

Por | febrero 11, 2010

A lo largo de estas semanas estoy volviendo a trabajar con enzimas de restricción y, antes de publicar un artículo sobre ciertas aplicaciones, será buena idea explicar un poco sobre el tema.
Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia. Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay un amplísimo catálogo de enzimas de restricción (podéis ver un ejemplo en el listado de Takara) y los usos destinados son varios: para la realización de mapas físicos (hablamos de ADN, no de cordilleras XDD), huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.
Con un ejemplo queda todo más claro: una enzima muy típica es Alu I que reconoce la secuencia AGTC y corta la doble hélice del ADN entre la Guanina y la Timina. Su actuación sería darse un paseo por toda la hebra de ADN en búsqueda de esa diana. En el momento que la encuentra, se ancla y corta, obteniéndose dos fragmentos. Si no hubiera esa secuencia diana, no corta y el fragmento de ADN de doble cadena que teníamos quedará igual que antes. Si os dais cuenta, es un buen método para diferenciar individuos. La variación de nucleótidos entre distintos individuos puede observarse de esta forma sin necesidad de secuenciar.
No se aplican estas enzimas a la totalidad del ADN genómico, ya que se obtendrían multitud de bandas que no se podrían distinguir bien. Se amplifican, mediante PCR, ciertos lugares específicos del ADN para que las dianas de restricción permitan obtener unos resultados claros para su posterior análisis.
Para los que trabajamos en un laboratorio esto que acabo de explicar es como usar el cuchillo en las comidas, pero ya he visto que hay cierto interés en ciertas aplicaciones de uso en el laboratorio y pronto haré una review de herramientas que facilitan el estudio mediante enzimas de restricción.
Por ahora, para que no sea un rollo lo que he explicado, os dejo con un vídeo (es una animación en 3D) sobre como actúa una enzima de restricción para clonar un fragmento de ADN. Recordad lo que es la clonación. Es una de las técnicas de ingeniería genética más comunes en los laboratorios de biología molecular. Se puede ver como la actuación de la enzima proporciona unos extremos en el plásmido (son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Plásmido bacterianoEstán presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula) que son complementarios al corte hecho a un fragmento de ADN que queremos insertar con la misma enzima de restricción. Por último serán unidos los extremos por otra enzima llamada ligasa. Así se puede incluir como si formara parte del plásmido y obtener copias idénticas del fragmento de interés al replicarse la bacteria.
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Espero que os haya gustado.


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24 interacciones en “Las enzimas de restricción

  1. avatarNancy

    Hola!!
    Me gusto mucho tu manera de explicar que son las enzimas de restricción, quisiera saber cual es el articulo que mencionas que publicaste para buscarlo.
    Saludos desde el laboratorio en México.
    Nancy

    Reply
    1. doctorGENoma Post author

      Hola Nancy. Supongo que te refieres a las primeras líneas en las que comento “[...]antes de publicar un artículo[...]“. Pero me refería a artículos posteriores en las que explico aplicaciones informáticas dirigidas al uso de enzimas de restricción. (Ver Restriction Mapper 3 y Enzyme X).
      Muchas gracias por tu comentario y espero que te siga gustando este Blog de laboratorio ;-D

      Reply
  2. avatarFer

    Me gusto mucho tu explicación, pero no me quedaron claras ciertas cosas (mi nivel es de 1º de Bioquímica de la carrera de Medicina, demasiado básico para entenderlo quizás).
    Te quería preguntar; cuando te refieres a que es un buen método para diferenciar individuos , por qué?
    Según he observado en el vídeo y he entendido de tu explicación. La enzima tras ”pasear” por el ADN reconoce unas bases y las corta por sus extremos. Esta secuencia que ha cortado a dónde va y para que sirve?
    La secuencia nueva que se vuelve a ligar al ADN es la misma o de dónde sale?

    Gracias.

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  3. doctorGENoma Post author

    @Fer: En cuanto a lo que me refiero a que es un buen método para diferenciar individuos es porque es una técnica sencilla y de bajo coste del que tan sólo necesitamos el ADN de los individuos a diferenciar. Lo que se suele hacer es disponer de ese ADN y amplificar una zona del genoma que sea muy variable. Al ser muy variable, pueden actuar las enzimas de restricción de distinta manera y cortar en unos casos y en otros no cortar. Así se pueden diferenciar individuos fácilmente. Esto es un caso en el que se sepa que la secuencia amplificada que se utiliza es variable entre individuos. Los screenings de polimorfismos sin saber si hay o no variaciones son más costosos.
    La segunda pregunta es un poco confusa. En el vídeo se muestra cómo actúa una enzima de restricción en un plásmido para ligar (unir) otro fragmento de ADN e incluirlo dentro del plásmido. Por tanto se genera un corte pero no en los extremos, si no en el interior del círculo y por tanto se forma una sóla doble cadena donde se incluirá en fragmento a clonar mediante la acción de la ligasa. Se incluye porque han sido cortados ambos (plásmido y fragmento a clonar) con la misma enzima y se generan unos extremos que serán complementarios a la hora de unirse. Si te refieres a un caso normal en el que se dispone de una amplificación de ADN y es esa la que se corta con la enzima de restricción, pues estamos ante un estudio genético y las muestras no van a ningún sitio. Se quedan en el recipiente donde se realice la reacción de corte con la enzima de restricción. Los fragmentos generados se pueden visualizar para su análisis en geles de electroforesis donde se observan las diferencias de tamaño de los fragmentos obtenidos.
    La última pregunta es de fácil respuesta y lo más seguro es que ya la hayas deducido con lo que te he comentado antes. Esa secuencia de la que hablas es un fragmento de ADN que se ha añadido al tubo de reacción donde se encontraba el plásmido circular y que fue cortado con la misma enzima de restricción que ese plásmido. Es un fragmento de ADN que se quiere clonar. Del que se quiere tener varias copias idénticas. Esto se logra al introducirse dentro del plásmido de esta forma y posteriormente el plásmido será transferido a la bacteria (que se utiliza Escherichia coli previamente tratada para que acepte al ADN fácilmente) que se replicará dando copias a su vez del plásmido ya que cada bacteria replicada es idéntica a su predecesora y por tanto también el plásmido que contenga.
    Si tienes alguna otra duda, no dudes en comentármela. Estos temas se pueden escapar a cualquiera que no tenga unas pocas nociones de ingeniería genética. Gracias por tu comentario.

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  4. avatarFer

    Muchas gracias, me ha quedado muy claro. Realmente impresionante.
    Tengo una duda que no tiene que ver con el tema de enzimas de restricción, pero quizás sepas contestarmela:
    ´La transcripción es monocatenaria, lo que significa que solo se transcribe una cadena, pero cuál de las 2 que hemos obtenido tras la replicación? La hebra conductora o la hebra retardada? Tiene alguna importancia que se transcriba una u otra y hay alguna forma de regularlo?

    Por último el profesor nos comentó algo del empalme alternativo, pero no quiso explicarnos porque dijo que era complejo; ¿me podrías hacer un breve resumen de lo que es? ¿Contradice de alguna forma todas las teorías que se creían ciertas hasta ahora?

    Siento aburrirte con tanto comentario. Te agradezco tu paciencia!

    Reply
  5. doctorGENoma Post author

    @Fer: Hola de nuevo. Siento la demora en la contestación, pero no he visto el momento oportuno para poder contestarte con un poco de tiempo dedicado. Entre fiestas y trabajo, se hace lo que se puede.
    El empalme alternativo (ó splicing alternativo) si que contradice en cierto modo el dogma de la genética que dice que ADN–>ARNm–>proteína. Esto es porque ese empalme especial puede dar lugar a distintos transcritos finales siendo el mismo gen de ADN inicial.
    El splicing tiene varias variantes pero, para explicártelo de forma simple consiste en que a partir del ADN que dará lugar a una proteína se genera un ARNm intermedio al final. Este ARNm intermedio tiene que madurar eliminando los intrones (regiones no codificantes) que están intercaladas entre los exones (regiones codificantes). La reordenación y corte y empalme de los fragmentos originará un ARN final que sí que se traducirá a proteína. Pero ese splicing puede dar tránscritos alternativos y, por tanto, variará la molécula final.
    La verdad es que es algo complicado explicártelo con más profundidad. Sin embargo, en genética la gran mayoría de los dogmas instaurados son relativos. Aunque no por ello excluyentes.
    Gracias por el comentario y espero que te haya servido de ayuda (aunque algo tarde).

    Reply
  6. avataryakob

    hola, @doctorGENoma mi duda es la siguiente
    ¿solo podemos encontrar endonucleasas en bacterias? es que yo he leido que en sistema de reparacion BER se utiliza una APendonucleasa y este sistema es utilizado en celulas eucariotas, ¿o no es asi?
    y la otra duda es que mencionas polimorfismo, quisiera saber la diferencia entre polimorfismo y mutacion…
    por favor
    ojala no te molestes y puedas contestarme rapido por que mi clase es el 28 de enero en la tarde…
    saludos, mi mail es amical_jz@hotmail.com

    Reply
  7. doctorGENoma Post author

    @yakob: La capacidad endonucleásica no es única de bacterias. Date cuenta que simplemente la ADN polimerasa tiene capacidad correctora de errores y endonucleásica para ese fin. Sin embargo, te voy a dar un ejemplo más práctico. Yo he trabajado con una endonucleasa que corta a nivel de missmatch al generar heterodúplex de un fragmento de ADN de individuos distintos. En resumen, detecta un desapareamiento de incluso una sola base y corta. Esta endonucleasa se encuentra en el Apio y también en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Y estas endonucleasas sí que se utilizan para la búsqueda de polimorfismos, tanto sean de un único núcleótido (SNPs) como que correspondan a deleciones o inserciones de varias pares de bases.
    En cuanto a la diferencia entre polimorfismo y mutación, es simple. Para poder denominar a una mutación como polimorfismo, ésta debe mostrarse en al menos el 1% de la población en el que se estudie. Por lo tanto, pueden haber mutaciones que den lugar a polimorfismos y otras que sean más puntuales y que no segreguen en la población. De todas formas sí que es verdad que tanto mutación como polimorfismo se refieran a distintas variantes alélicas para un gen (y gen es un término demasiado generalista. Yo diría mejor fragmento de ADN), pero se suele hablar siempre de polimorfismos en poblaciones ya que dictaminan si esa variación está presente en al menos un 1% de las mismas.
    Te enviaré la misma respuesta a tu correo electrónico de todos modos, Espero que te haya servido de ayuda y gracias por el comentario.

    Reply
  8. avataryakob

    ok muchas gracias ya me quedo muy claro…
    y lo de estudiar las celulas del Apio veo que es algo genial.
    ¿No es complicado estudiar una celula vegetal, mas que una bacteria? lo menciono por que rara vez o bueno ninguna vez habia leido el uso de celulas vegetales…. wow es genial

    saludos, desde Chiapas. Mexico

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  11. avatarCarla

    Hola que tal, quisiera saber si es que me podrias ayudar con un problema. Yo estoy buscando un polimorfismo, ya tengo mi secuencia del producto PCR, pero al buscar la enzima de restriccion no encuentro ninguna que tenga su sitio de reconocimiento en mi polimorfismo. Me podrias aconsejar que medidas puedo tomar?

    Reply
  12. doctorGENoma Post author

    @Carla: Tu caso se asimila a mi trabajo en mi tesis doctoral. Podrías utilizar ciertas endonucleasas tipo CEL (CEL I, CEL 2, ENDO 1, Mung bean) que permiten la digestión en lugares en los que existe un desapareamiento por diferencias en tan solo una par de bases y no son diana de enzimas de restricción. Para resumir, el método consiste en utilizar estas enzimas para digerir el heterodúplex formado por los fragmentos de ADN (productos de PCR) de los individuos que se diferencien entre sí por esa par de base. La enzima, al encontrar un pequeño desapareamiento en esa zona hibridada, corta la doble hélice. De esta forma, si tienes una progenie en la que analizar el polimorfismo, puedes observar las variaciones realizando hibridaciones mediante la formación de heterodúplex con uno de los progenitores y cada uno de los indiviuos de su progenie. Así, mediante un análisis comparativo entre los resultados obtenidos entre los progenitores y los posteriores con la progenie, puedes ver la variación de tu polimorfismo. Te dejo el enlace de un artículo en el que se desarrolla la técnica al completo. http://nar.oxfordjournals.org/content/26/20/4597.full. Por cierto. ¿de qué trata tu estudio?
    Espero que te haya servido de ayuda. y muchas gracias por tu comentario.

    Reply
  13. avatarcairo sotelo

    hola actualmente empece a trabajar en un laboratorio de biologia molecular y estoy haciendo pcr de unas muestras de HLB en citricos y mi tutor me dijo que ibamos a utilizar enzimas de restriccion y no estoy muy claro en cuanto al tema si me podrias ayudar por favor

    Reply
    1. doctorGENoma Post author

      Vuelve a leer todo el artículo y, si tienes alguna duda en especial, coméntame tus preguntas más específicamente. Gracias por el comentario ;)

      Reply
  14. avatarenzimassss

    Holaaa

    alguien sabe el percio aproximado de las enzimas de restricción?
    y donde puedo comprarlas?
    gracias

    Reply
    1. doctorGENoma Post author

      El precio de las enzimas de restricción varía tanto por la propia enzima elegida, por las unidades requeridas como también a la hora de elegir la casa comercial a la que hacer el pedido. Las enzimas más baratas pueden rondar los 20-25€ el vial aproximadamente. Puedes informarte sobre los precios de una de las compañías con un amplio catálogo como es New England Biolabs (puedes acceder mediante ESTE ENLACE al buscador de enzimas y verás diversos precios). Muchas gracias por el comentario (dudo si llamarte “enzimassss” o, mejor, Óscar ;D)

      Reply
  15. avatarpatricia

    ola

    me gustaria saber sobre los tamaños que quedam cuando cortamos un dna con esa enzima, considerando que las 2 enzimas estan a una distancia 1500 bp y el dna (circular) tiene tamaño de 4500bp. Si usamos solamente una enzima la otra no que tamaño quedara? 4500bp?

    Reply
  16. avatarkenlofi

    Hola;
    Primero decirte que me gusta mucho como explicas pero no tengo ni idea de biología ni de nada que se le relacione y tengo un par de preguntas que necesito resolver, espero que me puedas ayudar. Que pasa si juntamos dos fragmentos cortados con el mismo enzima de restrinción, y si fueron cortados con un enzima de restricion distinto?
    Muchas gracias.

    Reply
    1. doctorGENoma Post author

      Hola Kenlofi. A modo aclaratorio te comento que si quisieras unir fragmentos cortados con una misma enzima de restricción o intentar unir fragmentos cortados con distintas enzimas, se deben formar reacciones de ligación especiales con los componentes necesarios para su unión (ligación). En el caso hipotético que tuvieras fragmentos cortados con la misma enzima, en condiciones de ligación los fragmentos pueden unirse. La eficiencia de esa unión dependerá tanto de las reacciones de ligación como de los extremos obtenidos por los cortes de las enzimas. Hay que pensar de la misma manera si se han utilizado distintas enzimas de restricción. Sin embargo, el uso de las enzimas no es unir fragmentos al azar sino dirigir esa unión. Como expliqué en el artículo, esa unión se hace específicamente al querer incorporar un fragmento cortado en un plásmido bacteriano, por ejemplo, para ser clonado. En esos casos se busca la mayor especificidad para que la reacción de unión sea de gran rendimiento y se usan las mismas enzimas que generen los mismos extremos donde encajaría nuestro fragmento a clonar.
      Puede que todo esto sea algo difícil de comprender de primeras, pero piensa que las enzimas son tijeras que cortan piezas de puzzles. Te animo también que pases por Journal of Feelsynapsis y leas mi artículo dedicado a estas enzimas de restricción en el número 6 de la revista (AQUÍ la versión para descargar de ese número). Ya tienes una buena base y allí hice un repaso sencillo de estas proteínas catalíticas. Un saludo y gracias por el comentario.

      Reply
  17. avatarsongonchao

    Hola! Muy bueno el post, lo explicas todo con mucha claridad, pero aún así tengo una duda, porque las enzimas de restricción cromosómicas no cortan el DNA bacteriano.
    Muchas gracias!
    Un saludo.

    Reply
  18. avatarLucy Elena

    Hola buenas noches, soy de Perú y tengo una pregunta con respecto a las enzimas de restricción. Entiendo que la E.R se recorra el DNA hasta encontrar el sitio de restricción a la cual se une y corta el DNA. Mi duda es, ¿existe alguna explicación sobre la unión de enzima-secuencia? ya sea por alguna señal bioquímica, complementariedad geométrica o más alla sobre la especifidad? Muchas gracias de antemano. Tu post esta muy entendible.

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